BibTex RIS Kaynak Göster

Ssa1p function in the presence of nucleotide and Ssa1p oligomeric properties

Yıl 2011, Cilt: 33 Sayı: 1, 26 - 32, 14.03.2011

Öz

Abstract

Aim. To investigate S. cerevisiae cytosolic Hsp70-Ssa1 protein thermal unfolding in the presence of ATP and a substrate protein A7. Method. Plasmid preparation was done according to the standard protocols. pC210 was used to overexpress Ssa1p and Ssa1-A17V. Plasmids were linearized and integrated in Pichiapastoris (strain GS 115) genome. Transformants were selected by YPD/zeocin/sorbitol plates. Harvested cells were lysed by silica beads and centrifuged to homogenity. Lysate was purified by following chromatographic purification. Nucleotide free Ssa1 protein was obtained by using Sephadex G-50 column. Gel filtration experiments on binding and aggregation studies were performed by using Sephacryl-200 resin and one meter column. Fluorescence experiments were performed with Shimadzu RF 450 spectrofluorometer. Results. Both Ssa1p and Ssa1-A17V showed no significant difference in substrate protein binding. The binding to peptide reaches a maximum around 40 C and then a sharp decrease was seen. In the absence of nucleotides, both proteins form monomeric species between 20-40ºC. Above  oligomeric forms were observed. However, in the presence of 1 mM ATP oligomerization starts around 60ºC. Increase in temperature did not result in a second transition but a decrease in fluorescence was observed for both proteins. Conclusion. A7 and nucleotide ATP alters Ssa1p oligomeric properties and stability. This result is consistent with physiological conditions in a cell and explains how a cell survive under mild stress conditions through expressing Hsp70s.

Keywords: Hsp70, S. erevisiae, Ssa1p

 

Özet

Amaç. S. cerevisiae sitozolik Hsp70-Ssa1 proteinin ATP ve A7 substarat protein varlığında termal açılmasını araştırmak. Yöntem. Plasmid hazırlanması standart protokollere göre yapıldı pC210 Ssa1p ve Ssa1-A17V’yi yüksek ifade etmet için kullanıldı. Plasmidler çizgisel hale getirildi ve Pichiapastoris (zincir GS 115) genomuna eklendi. Transforme olmuş hücreler YPD/zeosin/sorbitol tabakaları kullanılarak seçildi. Elde edilmiş hücreler silika yardımıyla lize edildi ve homojenleştirmek için santrifuje edildi. Oluşan lizat kromotografik saflaştırmayı takiben saflaştırıldı. Nükleotidsiz Ssa1 proteini Sephadex G-50 kolonu kullanılarak elde edildi. Bağlamada ve yapışma çalışmalarındaki jel fitirasyon deneyleri Sephacryl-200 rezin ve 1 metre kolon kullanılarak uygulandı. Floresan deneyleri Shimadzu RF 450 spektrofotometre kullanılarak yapıldı. Bulgular. Her iki Ssa1p ve Ssa1-A17V substurat protein bağlamada belirgin fark göstermediler. Pepti’de bağlanma maksimuma 40 C civarında ulaşmaktaydı ve sonrasında keskin görüldü. Nükleotidlerin yokluğundan, her iki proteinde 20-40ºC arasında monomerik türler oluşturmaktadır. 40ºC ‘nin üzerinde oligomerik şekiller görüldü. Bununla beraber 1 mM ATP’nın varlığında oligomerizasyon  60ºC civarında başlar. Isının artması ikinci bir geçişle sonlanmaz fakat florasandaki bir düşüş iki protein içinde gözlemlenmişti. Sonuç. A7 ve nüleotid ATP Ssa1p oligomerik özelliklerini ve stabilitesini değiştirir. Bu sonuç bir hücredeki fizyolojik koşullarla uygunluk gösterir ve hafif stress koşullarında Hsp70’leri ifade ederek nasıl hayatta kaldığını açıklar.

Anahtar sözcükler: Hsp70, S. erevisiae, Ssa1p

 

Kaynakça

  • Tutar Y. Therapeutic use of heat shock proteins and essential factors in prognosis, diagnosis and treatment of neurodegenerative and metabolic diseases.Curr Pharm Biotechnol 2010; 11: 138.
  • Tutar L, Tutar Y. Heat shock proteins; an overview. Curr Pharm Biotechnol 2010; 11: 216-22.
  • Tutar Y. Prelude; cellular mechanics. Protein PeptLett 2009; 16: 570.
  • Tutar L, Tutar Y. Ydj1 but not Sis1 stabilizes Hsp70 protein under prolonged stress in vitro. Biopolymers 2008; 89: 171-4.
  • Tutar Y. Therapeutic use of heat shock protein 70. Recent Pat DNA Gene Seq 2007; 1: 125-7.
  • Tutar Y. Heat shock proteins, substrate specificity and modulation of function. Protein Pept Let 2006; 13: 699-705.
  • Tutar Y. Key residues involved in Hsp70 regulatory activity and affect of co- chaperones on mechanism of action. Protein PeptLett 2006; 13: 693-8.
  • Masison DC, Kirkland PA, Sharma D. Influence of Hsp70s and their regulators on yeast prion propagation. Prion 2009; 3: 65-73.
  • Reidy M, Masison DC. Sti1 regulation of Hsp70 and Hsp90 is critical for curing of Saccharomyces cerevisiae [PSI+] prions by Hsp104.Mol Cell Biol 2010; 30: 3542-52.
  • Tutar Y, Song Y, Masison DC. Primate chaperones Hsc70 (constitutive) and Hsp70 (induced) differ functionally in supporting growth and prion propagation in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 2006; 172: 851-61.
  • Song Y, Wu YX, Jung G, Tutar Y, Eisenberg E, Greene LE, Masison DC. Role for Hsp70 chaperone in Saccharomyces cerevisiae prion seed replication. Eukaryot Cell 2005; 4: 289-97.
  • Wegele H, Haslbeck M, Buchner J. Recombinant expression and purification of Ssa1p (Hsp70) from Saccharomyces cerevisiae using Pichiapastoris. J Chromatogr B AnalytTechnol Biomed Life Sci 2003; 786: 109-15.
  • Chirico WJ, Markey ML, Fink AL. Conformational changes of an Hsp70 molecular chaperone induced by nucleotides, polypeptides, and N- ethylmaleimide. Biochemistry 1998; 37: 13862-70.

Original research-Orijinal araştırma

Yıl 2011, Cilt: 33 Sayı: 1, 26 - 32, 14.03.2011

Öz

Amaç. S. cerevisiae sitozolik Hsp70-Ssa1 proteinin ATP ve A7 substarat protein varlığında termal açılmasını araştırmak. Yöntem. Plasmid hazırlanması standart protokollere göre yapıldı pC210 Ssa1p ve Ssa1-A17V’yi yüksek ifade etmet için kullanıldı. Plasmidler çizgisel hale getirildi ve Pichiapastoris YPD/zeosin/sorbitol tabakaları kullanılarak seçildi. Elde edilmiş hücreler silika yardımıyla lize edildi ve homojenleştirmek için santrifuje edildi. Oluşan lizat kromotografik saflaştırmayı takiben saflaştırıldı. Nükleotidsiz Ssa1 proteini Sephadex G-50 kolonu kullanılarak elde edildi. Bağlamada ve yapışma çalışmalarındaki jel fitirasyon deneyleri Sephacryl-200 rezin ve 1 metre kolon kullanılarak uygulandı. Floresan deneyleri Shimadzu RF 450 spektrofotometre kullanılarak yapıldı. Bulgular. Her iki Ssa1p ve Ssa1-A17V substurat protein bağlamada belirgin fark göstermediler. Pepti’de bağlanma maksimuma 40 ○C civarında ulaşmaktaydı ve sonrasında keskin görüldü. Nükleotidlerin yokluğundan, her iki proteinde 20-40ºC arasında monomerik türler oluşturmaktadır. 40ºC ‘nin üzerinde oligomerik şekiller görüldü. Bununla beraber 1 mM ATP’nın varlığında oligomerizasyon 60ºC civarında başlar. Isının artması ikinci bir geçişle sonlanmaz fakat florasandaki bir düşüş iki protein içinde gözlemlenmişti. Sonuç. A7 ve nüleotid ATP Ssa1p oligomerik özelliklerini ve stabilitesini değiştirir. Bu sonuç bir hücredeki fizyolojik koşullarla uygunluk gösterir ve hafif stress koşullarında Hsp70’leri ifade ederek nasıl hayatta kaldığını açıklar

Kaynakça

  • Tutar Y. Therapeutic use of heat shock proteins and essential factors in prognosis, diagnosis and treatment of neurodegenerative and metabolic diseases.Curr Pharm Biotechnol 2010; 11: 138.
  • Tutar L, Tutar Y. Heat shock proteins; an overview. Curr Pharm Biotechnol 2010; 11: 216-22.
  • Tutar Y. Prelude; cellular mechanics. Protein PeptLett 2009; 16: 570.
  • Tutar L, Tutar Y. Ydj1 but not Sis1 stabilizes Hsp70 protein under prolonged stress in vitro. Biopolymers 2008; 89: 171-4.
  • Tutar Y. Therapeutic use of heat shock protein 70. Recent Pat DNA Gene Seq 2007; 1: 125-7.
  • Tutar Y. Heat shock proteins, substrate specificity and modulation of function. Protein Pept Let 2006; 13: 699-705.
  • Tutar Y. Key residues involved in Hsp70 regulatory activity and affect of co- chaperones on mechanism of action. Protein PeptLett 2006; 13: 693-8.
  • Masison DC, Kirkland PA, Sharma D. Influence of Hsp70s and their regulators on yeast prion propagation. Prion 2009; 3: 65-73.
  • Reidy M, Masison DC. Sti1 regulation of Hsp70 and Hsp90 is critical for curing of Saccharomyces cerevisiae [PSI+] prions by Hsp104.Mol Cell Biol 2010; 30: 3542-52.
  • Tutar Y, Song Y, Masison DC. Primate chaperones Hsc70 (constitutive) and Hsp70 (induced) differ functionally in supporting growth and prion propagation in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 2006; 172: 851-61.
  • Song Y, Wu YX, Jung G, Tutar Y, Eisenberg E, Greene LE, Masison DC. Role for Hsp70 chaperone in Saccharomyces cerevisiae prion seed replication. Eukaryot Cell 2005; 4: 289-97.
  • Wegele H, Haslbeck M, Buchner J. Recombinant expression and purification of Ssa1p (Hsp70) from Saccharomyces cerevisiae using Pichiapastoris. J Chromatogr B AnalytTechnol Biomed Life Sci 2003; 786: 109-15.
  • Chirico WJ, Markey ML, Fink AL. Conformational changes of an Hsp70 molecular chaperone induced by nucleotides, polypeptides, and N- ethylmaleimide. Biochemistry 1998; 37: 13862-70.
Toplam 13 adet kaynakça vardır.

Ayrıntılar

Birincil Dil İngilizce
Bölüm Temel Tıp Bilimleri Araştırma Yazıları
Yazarlar

Yusuf Tutar

Yayımlanma Tarihi 14 Mart 2011
Yayımlandığı Sayı Yıl 2011Cilt: 33 Sayı: 1

Kaynak Göster

AMA Tutar Y. Ssa1p function in the presence of nucleotide and Ssa1p oligomeric properties. CMJ. Mart 2011;33(1):26-32.