Cumhuriyet Medical Journal

Öz

Abstract

Aim. To investigate S. cerevisiae cytosolic Hsp70-Ssa1 protein thermal unfolding in the presence of ATP and a substrate protein A7. Method. Plasmid preparation was done according to the standard protocols. pC210 was used to overexpress Ssa1p and Ssa1-A17V. Plasmids were linearized and integrated in Pichiapastoris (strain GS 115) genome. Transformants were selected by YPD/zeocin/sorbitol plates. Harvested cells were lysed by silica beads and centrifuged to homogenity. Lysate was purified by following chromatographic purification. Nucleotide free Ssa1 protein was obtained by using Sephadex G-50 column. Gel filtration experiments on binding and aggregation studies were performed by using Sephacryl-200 resin and one meter column. Fluorescence experiments were performed with Shimadzu RF 450 spectrofluorometer. Results. Both Ssa1p and Ssa1-A17V showed no significant difference in substrate protein binding. The binding to peptide reaches a maximum around 40 ^○C and then a sharp decrease was seen. In the absence of nucleotides, both proteins form monomeric species between 20-40ºC. Above  oligomeric forms were observed. However, in the presence of 1 mM ATP oligomerization starts around 60ºC. Increase in temperature did not result in a second transition but a decrease in fluorescence was observed for both proteins. Conclusion. A7 and nucleotide ATP alters Ssa1p oligomeric properties and stability. This result is consistent with physiological conditions in a cell and explains how a cell survive under mild stress conditions through expressing Hsp70s.

Keywords: Hsp70, S. erevisiae, Ssa1p

Özet

Amaç. S. cerevisiae sitozolik Hsp70-Ssa1 proteinin ATP ve A7 substarat protein varlığında termal açılmasını araştırmak. Yöntem. Plasmid hazırlanması standart protokollere göre yapıldı pC210 Ssa1p ve Ssa1-A17V’yi yüksek ifade etmet için kullanıldı. Plasmidler çizgisel hale getirildi ve Pichiapastoris (zincir GS 115) genomuna eklendi. Transforme olmuş hücreler YPD/zeosin/sorbitol tabakaları kullanılarak seçildi. Elde edilmiş hücreler silika yardımıyla lize edildi ve homojenleştirmek için santrifuje edildi. Oluşan lizat kromotografik saflaştırmayı takiben saflaştırıldı. Nükleotidsiz Ssa1 proteini Sephadex G-50 kolonu kullanılarak elde edildi. Bağlamada ve yapışma çalışmalarındaki jel fitirasyon deneyleri Sephacryl-200 rezin ve 1 metre kolon kullanılarak uygulandı. Floresan deneyleri Shimadzu RF 450 spektrofotometre kullanılarak yapıldı. Bulgular. Her iki Ssa1p ve Ssa1-A17V substurat protein bağlamada belirgin fark göstermediler. Pepti’de bağlanma maksimuma 40 ^○C civarında ulaşmaktaydı ve sonrasında keskin görüldü. Nükleotidlerin yokluğundan, her iki proteinde 20-40ºC arasında monomerik türler oluşturmaktadır. 40ºC ‘nin üzerinde oligomerik şekiller görüldü. Bununla beraber 1 mM ATP’nın varlığında oligomerizasyon  60ºC civarında başlar. Isının artması ikinci bir geçişle sonlanmaz fakat florasandaki bir düşüş iki protein içinde gözlemlenmişti. Sonuç. A7 ve nüleotid ATP Ssa1p oligomerik özelliklerini ve stabilitesini değiştirir. Bu sonuç bir hücredeki fizyolojik koşullarla uygunluk gösterir ve hafif stress koşullarında Hsp70’leri ifade ederek nasıl hayatta kaldığını açıklar.

Anahtar sözcükler: Hsp70, S. erevisiae, Ssa1p